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心肌活力饮对实验性扩张型心肌病大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因的影响

       摘自：2008年11月第15卷第11期《中国中医药信息杂志》（论文）
摘要：
    目的  观察心肌活力饮对扩张型心肌病大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因的影响，探讨该药治疗扩张型心肌病的作用机理。
    方法  60只动物随机分成6组，除正常对照组外，其余各组大鼠分别腹腔注射阿霉素，制造扩张型心肌病模型。各用药组分别予心肌活力饮、黄芪生脉饮灌胃给药。4周后采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡及凋亡相关基因p53和Fas的蛋白表达。
    结果  模型组心肌细胞的凋亡率显著高于正常对照组（P<0.01），凋亡促进基因p53和Fas的蛋白表达增高（P<0.05）。心肌活力饮（5、10、20 g原药材/kg）组大鼠心肌细胞相关凋亡基因p53和Fas的蛋白表达量比模型组减少（P<0.05或P<0.01），心肌细胞的凋亡率也明显降低（P<0.01）。
    结论  心肌活力饮可以减少实验性扩张型心肌病大鼠心肌细胞的凋亡，并且可能是通过抑制心肌细胞相关凋亡基因p53和Fas的表达而发挥此作用的。
    扩张型心肌病是一种原因不明的以心腔扩大为特征的心脏病，其临床表现为心力衰竭和心律失常，病死率较高，目前尚无十分有效的治疗方法。本实验在建立扩张型心肌病大鼠模型的基础上应用心肌活力饮，并与阳性对照药物进行比较，旨在进一步探讨该药治疗扩张型心肌病的作用机理。
1    实验材料
1.1  药物和试剂
    心肌活力饮（100.5 g原材药/袋）,石家庄长城中西医结合医院提供；黄芪生脉饮，浙江新光药业有限公司产品，批号20051139；注射用盐酸多柔比星（阿霉素），浙江海正药业股份有限公司产品，批号050803。
1.2  动物
    雄性SD大鼠（二级）60只，体重180～200 g，河北省实验动物中心提供，许可证号为SCXK（冀）2003-1-003，动物饲料亦由该中心提供。
1.3  仪器
    FACS420型流式细胞仪，美国BD公司。
2    实验方法
2.1  分组及造模
    将大鼠随机分成6组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、心肌活力饮小剂量组（5 g原药材/kg）、心肌活力饮中剂量组（10 g原药材/kg）、心肌活力饮大剂量组（20g原药材/kg）及阳性药黄芪生脉饮组（7 mL/kg）。
    除正常对照组外,其余各组大鼠分别腹腔注射阿霉素（2.5 mg/kg），每周3次，共4周，同时给药组连续灌胃给药，每日1次，容量为1 mL/100 g体重，正常对照组及模型对照组给予等量蒸馏水。
2.2  心肌细胞凋亡及凋亡相关基因的检测
    上述实验结束后，各组大鼠用水合氯醛麻醉（350 mg/kg，腹腔注射），剖取心脏，采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况以及凋亡相关基因p53和Fas蛋白的表达。
    取心肌组织2g，70%乙醇固定，剪碎，制备单细胞悬液，同时设阴性对照，以替代一抗，阳性对照只加一抗或只加二抗，碘化丙啶染色，流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡，数据采集为对数（log）方式，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析。计数10 000个细胞，计算凋亡率。
    凋亡率(%)＝凋亡细胞数/细胞总数×100%[NextPage]
2.3  统计学方法
    采用SPSS11.5 for windows统计软件，数据以—x±s表示，经方差齐性检验后，进行t检验比较各组间差异，以P<0.05为差异有统计学意义。
3    结果（表1）
表1心肌活力饮对各组大鼠心肌细胞凋亡率及p53和Fas蛋白表达的影响（—x±s）

组别	剂量	凋亡率(%)	p53蛋白表达（荧光值）	Fas蛋白表达（荧光值）
正常对照组		4.55±0.77**	2 386.2±421.93**	3 719.2±531.99**
模型对照组		6.15±0.86	3268.9±385.39	5546.1±875.82
心肌活力饮小剂量组	5 g/kg	5.18±0.51**	2550.4±332.87**	4 759.4±808.39
心肌活力饮中剂量组	10 g/kg	4.92±0.78**	2 685.1±397.25**	4 598.2±604.97*
心肌活力饮大剂量组	20 g/kg	5.04±0.97**	2748.6±252.94**	4276.7±473.66*
黄芪生脉饮组	7 mL/kg	4.74±0.94**	2593.3±345.41**	4173.7±539.17**

        注：与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
4    讨论
    扩张型心肌病属中医“温病”、“心痹”、“心悸”等范畴。中医认为，本病的发生与先天禀赋特异体质、后天调摄失宜及反复温热毒邪侵袭等因素有关，正气不足、热毒侵心是本病发病的关键。本病病位在心，并可累及肺、脾、肾等脏，以正气不足为本，热毒、瘀血、痰饮为标，病情严重则发展为心阳暴脱、阴阳离决而猝死。
    西医对于扩张型心肌病发病机制的认识并不十分明确，近年来，随着对扩张型心肌病发病机理研究的不断进展，越来越多的证据显示，心肌细胞凋亡在扩张型心肌病的发生和发展中起着重要的作用。李氏等采用原位细胞凋亡法对21例扩张型心肌病患者的心肌组织进行检测发现：与正常心脏相比，扩张型心肌病中凋亡的心肌细胞明显增多，同时心肌细胞的凋亡数量与心功能的状况呈正相关。
    近年来，关于细胞凋亡分子机制的研究有了很大的突破，其中基因p53和Fas与细胞凋亡相关性的研究较多。研究发现，心力衰竭动物模型和心力衰竭终末期的心肌组织Fas mRNA表达上调，表达Fas蛋白的心肌细胞显著增多，与心功能分级呈正相关。心肌细胞Fas表达增多又促进心肌细胞凋亡。
    本实验结果显示，模型组心肌细胞的凋亡率较正常对照组明显增加。心肌活力饮治疗组心肌细胞凋亡较模型组明显减少，凋亡相关基因p53和Fas的蛋白表达亦明显减少。不同剂量心肌活力饮组间比较，心肌细胞凋亡及凋亡相关基因蛋白表达没有明显差异，可能与样本量较小有关。上述研究表明，心肌活力饮可以减少实验性扩张型心肌病大鼠心肌细胞的凋亡，并且可能是通过抑制心肌细胞相关凋亡基因p53和Fas的表达而发挥此作用的。

 

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